Geredigeer deur Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornië, goedgekeur op 25 Desember 2020 (hersien op 25 Oktober 2020)
Ons rapporteer die interaksie tussen subeenhede in die replikasie van koronavirus-transkripsiekomplekse, wat noodsaaklik is vir replikasie en evolusionêre bewaring.Ons het bewyse gelewer dat die NiRAN-domein wat met nsp12 geassosieer word, nukleosiedmonofosfaat (NMP)-transferase-aktiwiteit in trans het, en nsp9 ('n RNA-bindende proteïen) as sy teiken geïdentifiseer.NiRAN kataliseer die kovalente aanhegting van die NMP-eenheid aan die gekonserveerde nsp9-aminoterminus in 'n reaksie wat staatmaak op Mn2+-ione en aangrensende gekonserveerde Asn-reste.Daar is gevind dat NiRAN-aktiwiteit en nsp9 NMPilering noodsaaklik is vir koronavirusreplikasie.Die data stel ons in staat om hierdie aktiwiteit van die geneste virus-ensiemmerker te koppel aan die vorige waarnemings in die hipotese dat die aanvang van RNA-sintese in 'n klas RNA-virusse funksioneel en evolusionêr konsekwent is.
Die RNA-afhanklike RNA-polimerase (RdRps) van Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae en 12 ander families) is gekoppel aan die amino-terminale (N-terminale) domein in die nie-strukturele proteïen (nsp) wat vrygestel word van die poliproteïen, genoem NiRAN 1ab is saamgestel uit virale hoofprotease (Mpro).Voorheen is die arteriële virus NiRAN-RdRp nsp se eie GMPilering/UMPilasie aktiwiteit gerapporteer, en dit is voorgestel om 'n verbygaande te genereer vir die oordrag van nukleosiedmonofosfaat (NMP) na die (tans onbekende) virus en/of selbiopolimerisasie Dinge.Hier wys ons dat die koronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E en Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-afhanklike NMPileringsaktiwiteit het, wat van nsp9 afgelei word deur die vorming van Mpro-gemedieerde nsp9. die N-terminale flankerende nsps word proteolities vrygestel, die fosforamidaat word aan die primêre amien (N3825) by die N-terminaal van nsp9 gebind.Uridientrifosfaat is die voorkeurnukleotied in hierdie reaksie, maar adenosientrifosfaat, guanosientrifosfaat en sitidientrifosfaat is ook geskikte ko-substrate.Mutasiestudies met behulp van rekombinante koronavirus nsp9 en nsp12 proteïene en geneties gemanipuleerde HCoV-229E mutante het die residue bepaal wat nodig is vir NiRAN-gemedieerde nsp9 NMPilering en virusreplikasie in selkultuur.Die data het die voorspelling van NiRAN aktiewe plek residue bevestig en die belangrike rol van nsp9 N3826 residue in nsp9 NMPilering en virus replikasie in vitro bepaal.Hierdie oorblyfsel is deel van die bewaarde N-terminale NNE tripeptiedvolgorde en het geblyk die enigste onveranderlike oorblyfsel van nsp9 en sy homoloë in die koronavirusfamilie te wees.Hierdie studie verskaf 'n stewige grondslag vir die funksionele studie van NMPileringsaktiwiteit van ander geneste virusse en stel moontlike teikens vir die ontwikkeling van antivirale middels voor.
Nidovirales positief-string RNA virus infekteer 'n verskeidenheid van gewerwelde en ongewerwelde diere (1, 2).Die bestelling sluit tans 14 gesinne (3) in, waarvan die Coronavirus-familie die afgelope 20 jaar omvattend bestudeer is.Op daardie tydstip het drie soönotiese koronavirusse uit dieregashere ontstaan en grootskaalse uitbrekings van ernstige respiratoriese infeksies by mense veroorsaak.Insluitend aanhoudende pandemies wat veroorsaak word deur ernstige akute aansteeklike siektes.Respiratoriese sindroom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidovirusse deel 'n gemeenskaplike genoomorganisasie, en die subeenheid van die membraangebonde replikasie-transkripsiekompleks (RTC) word gekodeer in die 5-?²-terminale tweederdes en die hoofstrukturele subeenheid van die virusdeeltjie, sowel as sommige bykomstighede .Proteïen, gekodeer in die 3??² eind derde van die genoom (1).Behalwe vir een familie van planêre virusse (Monoviridae) (8), kodeer alle geneste virusse vir RTC subeenhede in twee groot oop leesrame (ORF) ORF1a en ORF1b, wat vertaal word vanaf genomiese RNA van.ORF1a kodeer poliproteïen (pp) 1a, en ORF1a en ORF1b kodeer gesamentlik pp1ab.Met die algemene deelname van die hoofprotease (Mpro) wat deur ORF1a gekodeer word, word beide pp1a en pp1ab proteolities verwerk tot 'n verskeidenheid nie-strukturele proteïene (nsps), ook bekend as 3CLpro, omdat dit homologie het met die 3Cpro van die picornavirus ( 9).Hierdie nsps word vermoedelik saamgestel in 'n groot dinamiese RTC, kataliseer die sintese van genomiese RNA (replikasie) en 'n stel subgenomiese RNA (transkripsie), en word gebruik om die uitdrukking van die ORF wat stroomaf van ORF1b geleë is te koördineer (10? ? ?12).
Die kern RTC sluit RNA-afhanklike RNA-polimerase (RdRp) (13), superfamilie 1-helikase (HEL1) (14, 15) en verskeie RNA-prosesseringsensieme in, wat hoofsaaklik in ORF1b en in die koronavirusfamilie gekodeer word. Dit bevat nsp12-nsp16 en nsp9-nsp12 in die Arterioviridae-familie (sien verwysing 10ââ 12).RdRp en HEL1 verteenwoordig twee (een vyfde) bewaarde domeine van die voëlnesvirus en het homologie onder ander RNA-virusse.Daar word geglo dat kernreplikase bygestaan word deur ander subeenhede, insluitend verskeie klein nsps wat vrygestel word vanaf die karboksieterminaal (C-terminaal) streek van pp1a, stroomaf van Mpro (koronavirus nsp5 en arteriële virus nsp4, onderskeidelik).Hulle het beperkte gesinspesifieke beskerming en diverse aktiwiteite (hersien in verwysing 10ââ12).
Relatief onlangs is 'n domein met unieke volgorde-motiefkenmerke gevind by die aminoterminus (N-terminus) langs RdRp in alle geneste virusse, maar geen ander RNA-virusse nie (16).Op grond van sy ligging en nukleotiedtransferase (nukleosiedmonofosfaat [NMP] transferase) aktiwiteit, word hierdie domein NiRAN (Nestvirus RdRp-verwante nukleotiedtransferase) genoem.Die dubbel-domein kombinasie van NiRAN-RdRp vorm nsp12 in die Coronaviridae familie en nsp9 in die Arterioviridae familie, en in ander nestoviridae word verwag dat NiRAN-RdRp as 'n onafhanklike nsp van die virale poliproteïen vrygestel sal word.In die koronavirus bevat die NiRAN-domein ??1/450-residu en is dit verbind met die C-terminale RdRp-domein deur die skakelgebied (16?19).In Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), toon rekombinante nsp9 Mn2+ ioon-afhanklike (self) UMPilering en GMPilasie aktiwiteite, wat afhanklik is van drie gekonserveerde volgorde basisse in nestovirus, AN, BN en CN Die residue in die volgorde.Waar N staan vir NiRAN) (16).Die N-terminale flankering van hierdie motiewe is 'n minder konserwatiewe motief preAN.Sommige van hierdie oorblyfsels word ook bewaar in ver-verwante proteïenkinases, waar getoon is dat dit betrokke is by nukleosiedtrifosfaat (NTP) binding en katalitiese aktiwiteit (20, 21).In ooreenstemming met hierdie waarneming, kan verskeie sleutel aktiewe terreinresidue in die pseudokinase SelO van Pseudomonas syringae saamgestel word met die onlangs gepubliseerde SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleks.Bewaarde Coronavirus NiRAN-reste wat in die elektronmikrostruktuur gesuperponeer is.Rekombinante proteïen (17).Daar word bespiegel dat die gedokumenteerde (self) U/GMPilering 'n verbygaande toestand sal produseer om NMP na die (tans onbekende) substraat (16) oor te dra, en die strukturele ooreenkoms tussen NiRAN en proteïenkinase (17, 19) ) Is die hipotese dat NiRAN verander ander proteïene.
Baie kenmerke, insluitend sy unieke en unieke sistematiese assosiasie met geneste virusse en genetiese skeiding van RdRp, maak NiRAN 'n redelike sleutel regulatoriese ensiem vir geneste virusse, wat van kritieke belang is vir hul opkoms en identiteit.Voorheen is drie moontlike funksies wat NiRAN behels om genoom/subgenomiese translasie of replikasie/transkripsie te reguleer genoem.Wanneer die skaars en onvolledige data wat destyds beskikbaar was, in ag geneem word, het elke funksie sy voordele en nadele (16).In hierdie navorsing poog ons om die biochemiese en omgekeerde genetiese studies van die koronavirusse wat die twee genera verteenwoordig, te kombineer en ons bevindinge in die evolusionêre agtergrond van die natuurlike mutasie van die koronavirusfamilie te plaas, om sodoende insig te kry in hierdie geheimsinnige ryk.Ons rapporteer groot vooruitgang in die begrip van NiRAN deur die identifikasie van natuurlike teikens in RTC, wat (onder die drie beskikbare hipoteses) bydra tot die rol van hierdie domein in die inisieer van die sintese van geneste virus-RNA.Hierdie navorsing maak ook moontlikhede oop vir ander rolle van NiRAN op die virusgasheerkoppelvlak.
Om die ensiematiese eienskappe van die koronavirus nsp12-verwante NiRAN-domein te karakteriseer, het ons 'n rekombinante vorm van menslike koronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli vervaardig, met 'n His6-merker by die C-terminus, en gekombineer die proteïen met [α32-P ] Inkubeer saam met NTP in die teenwoordigheid van MnCl2 soos beskryf in Materiale en Metodes.Die ontleding van die reaksieproduk het die teenwoordigheid van 'n radio-gemerkte proteïen aangedui wat saam met nsp12 (106 kDa) migreer, wat aandui dat koronavirus nsp12 die vorming van kovalente proteïen-NMP-addukte kataliseer, verkieslik gevorm met uridienmonofosfaat (UMP) (Figuur 1A) en B).Kwantitatiewe analise het getoon dat in vergelyking met ander nukleotiede, die seinintensiteit van UMP-inkorporasie met 2 tot 3 keer toegeneem het (Figuur 1C).Hierdie data stem ooreen met die voorspelde NMP-oordragase-aktiwiteit van die NiRAN-domein van die koronavirus (16), maar dui aan dat die nukleotiedvoorkeure van die NiRAN-domein van die koronavirus en die arteriële virus verskil.
Self-NMPileringsaktiwiteit van HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) is geïnkubeer met die aangewese [α-32P] NTP in die teenwoordigheid van 6 mM MnCl2 vir 30 minute (sien Materiale en Metodes vir besonderhede).Die reaksieprodukte is deur SDS-PAGE geskei en met Coomassie briljantblou gekleur.(B) Die radio-gemerkte proteïen word gevisualiseer deur fosforbeelding.Die posisies van nsp12-His6 en proteïen molekulêre massa merkers (in kilodaltons) word in A en B getoon. (C) Die intensiteit van die radioaktiewe sein (gemiddeld ± SEM) is uit drie onafhanklike eksperimente bepaal.*P≤0,05.Die seinsterkte (persentasie) hou verband met UTP.
Alhoewel daar bewys is dat NiRAN-verwante ensiemaktiwiteite noodsaaklik is vir die replisering van EAV en SARS-CoV in selkultuur (16), is die spesifieke NiRAN-funksie en potensiële teikens nog nie bepaal nie.Die onlangs gerapporteerde strukturele ooreenkoms tussen NiRAN en 'n familie van proteïene met proteïenkinase-agtige voue (17, 22) het ons aangespoor om die hipotese te toets dat NiRAN die NMPilering van ander proteïene kataliseer.Ons het 'n stel potensiële homoloë teikens gegenereer, insluitend nie-strukturele proteïene gekodeer deur HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), wat elk 'n C-terminale His6 merker bevat (SI bylaag, Tabel S1), en inkubeer hierdie proteïene met [α32-P] uridientrifosfaat ([α32-P]UTP) in die teenwoordigheid of afwesigheid van nsp12.Beeserumalbumien en MBP-LacZα-fusieproteïen wat in E. coli geproduseer is, het as kontroles gedien (Figuur 2A, bane 1 tot 7).Die radio-gemerkte proteïen is ontleed deur natriumdodesielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese (SDS-PAGE) en outoradiografie, en daar is gevind dat daar 'n sterk radioaktiewe sein in die reaksie was wat nsp12 en nsp9 bevat.Die posisie van die sein stem ooreen met die molekulêre massa van nsp9, wat nsp12-gemedieerde UMPilering van nsp9 aandui (Figuur 2B, baan 7).Geen ander toetsproteïene is gevind om UMPileer te wees nie, wat daartoe gelei het dat ons tot die gevolgtrekking gekom het dat nsp9 'n spesifieke substraat van nsp12 is.In ooreenstemming met die self-NMPileringsdata wat in Figuur 1 getoon word, is nsp12 in staat om al vier NMP's na nsp9 oor te dra, alhoewel die doeltreffendheid verskil, UMP> adenosienmonofosfaat (AMP)> guanosienmonofosfaat (GMP)> sitidienmonofosfaat (CMP) ) ( Prent).3 A en B).Onder die toestande wat in hierdie toets gebruik word (verkort die reaksie en blootstellingstyd, verminder die konsentrasie van nsp12; materiale en metodes), kon die self-NMPilering van nsp12 nie opgespoor word nie (vergelyk Figuur 2B, baan 7 en Figuur 1B), wat bewys dat 'n effektiewe (En veelvuldige rondtes) UMP van nsp12 na nsp9 beweeg het.UMP-transferase-aktiwiteit vereis die teenwoordigheid van Mn2+-ione, soos getoon in Figuur 3C, terwyl slegs minimale UMP-transferase-aktiwiteit in die teenwoordigheid van Mg2+ waargeneem is, en geen aktiwiteit in die teenwoordigheid van die ander twee tweewaardige katione wat getoets is nie.Soortgelyke data is verkry in NMPileringstoetse wat sitidientrifosfaat (CTP), guanosientrifosfaat (GTP) en adenosientrifosfaat (ATP) bevat (SI-bylaag, Figuur S1).
HCoV-229E nsp12-gemedieerde UMPilering van nsp9.'n Reeks proteïensubstrate (insluitend beeserumalbumien, MBP-lacZα, en 'n reeks HCoV-229E nsps gemerk met C-terminaal His6 gekodeer deur ORF1a) is gebruik om die UMPileringsaktiwiteit van HCoV-229E nsp12-His6⁺-gemedieerde te evalueer proteïen.Inkubeer die proteïen met [α-32P] UTP vir 10 minute in die afwesigheid (A) of teenwoordigheid (B) van nsp12 soos beskryf in die materiale en metodes.Aan die bokant van A en B word SDS-poliakrielamiedgel wat met Coomassie Brilliant Blue gekleur is getoon, en onderaan A en B word die ooreenstemmende outoradiogramme getoon.Die posisie van die proteïen molekulêre massa merker (in kilodaltons) word aan die linkerkant gegee.Die posisie van nsp12-His6 (B, bo) en die radioaktiewe sein wat tydens die inkubasie van nsp12-His6 met nsp9-His6 (B, baan 7) waargeneem is, word ook aangedui, wat aandui dat [α-32P]UMP na nsp9-His6 (12.9 kDa), wat nie waargeneem is vir ander proteïene wat getoets is nie.
HCoV-229E NiRAN-gemedieerde biochemiese en virologiese karakterisering van nsp9 NMPilering.(A en B) Die rol van die nukleotied-ko-substraat wat in die reaksie gebruik word.Nsp12-His6 en nsp9-His6 word gemeng en geïnkubeer in die teenwoordigheid van verskillende [α-32P] NTP's in die standaard NMPileringstoets.(A, bo) Coomassie-gekleurde nsp9-His6 geskei deur SDS-BLADSY.(A, onder) Autoradiografie van dieselfde area van die gel.(B) Die relatiewe aktiwiteit (gemiddeld ± SEM) in die teenwoordigheid van die aangewese nukleotiedkofaktor word bepaal uit drie onafhanklike eksperimente.*P≤0,05.(C) Die rol van metaalione.Getoon word die standaard NMPileringstoets in die teenwoordigheid van [α-32P] UTP en verskillende metaalione, elk met 'n konsentrasie van 1 mM.In C word die boonste, Coomassie-gekleurde nsp9-His6 getoon, en in C, die onderste, word die ooreenstemmende outoradiografie getoon.Die grootte van die gemerkte proteïen (in kilodaltons) word aan die linkerkant van A en C getoon. (D) Die mutante vorm van HCoV-229E nsp12-His6 wat die gespesifiseerde aminosuurvervanging dra, is in [α-32P]UTP, soos beskryf in Materiale en Metodes.Die radio-gemerkte nsp9-His6 wat in die NMPileringsreaksie geproduseer word, word opgespoor deur fosforileringsbeelding (D, bo).Die relatiewe aktiwiteit in vergelyking met die wilde-tipe (wt) proteïen word in D getoon, en die onderkant word geneem as die gemiddelde (±SEM) van drie onafhanklike eksperimente.Sterretjies dui vervangings van nie-gekonserveerde residue aan.(E) Die virustiter in die kultuursupernatant van p1-selle wat 24 uur na infeksie verkry is, is deur plaaktoets bepaal.Die kodonvervangings in die NiRAN-domein van die gemanipuleerde HCoV-229E-mutant word aangedui (residunommering is gebaseer op hul posisie in pp1ab).Die replikasie-defekte RdRp aktiewe plek mutant nsp12_DD4823/4AA is as 'n kontrole gebruik.
Om 'n dieper begrip van die aktiewe plek van NiRAN te verkry en die residue wat verband hou met die aktiwiteit van nsp9-spesifieke NMP-oordragase te bepaal, het ons mutasie-analise uitgevoer, waarin ons die konserwatiewe residue in die NiRAN AN-, BN- en CN-motiewe ( 16) Dit is Ala (SI-bylaag, Figuur S2).Daarbenewens is die impak van konserwatiewe Arg-tot-Lys of Lys-tot-Arg substitusies in twee gevalle geëvalueer.As 'n (negatiewe) kontrole word residue wat nie of minder in die NiRAN-domein van koronavirusse en ander geneste virusse bewaar is nie, vervang met Ala. Vervanging van K4116A (in motief preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motief) BN) en D4280A (CN) aansienlik verminder of selfs elimineer nsp9 NMPilering deur nsp12, terwyl proteïene met konserwatiewe substitusies (R4178K), K4116R) 60% en 80% van hul aktiwiteit behou, wat daarop dui dat die verslapping van die beperkings aan hul onderskeie kant kettings is fisies-chemies sensitief (Figuur 3D).Die vervanging van verskeie ander bewaarde residue E4145A, D4273A, F4281A en D4283A is baie minder skadelik, en nsp9 UMPilering is slegs matig verminder.Soortgelyke resultate is verkry in nsp9 NMPileringsreaksies wat ander NTP's betrek (Figuur 3D en SI-bylaag, Figuur S3), wat bevestig dat die waargenome effekte op spesifieke aminosuursubstitusies onafhanklik is van die tipe nukleotied-ko-substraat wat gebruik word.Vervolgens het ons die moontlike impak van hierdie nsp12-vervangings op die replikasie van koronavirusse in selkultuur getoets.Vir hierdie doel het ons toepaslike geneties gemanipuleerde komplementêre DNA (cDNA) sjablone gebruik wat in rekombinante vaccinia virus (23, 24) gekloneer is om 5 -7 selle te transkribeer.Titrasie van aansteeklike virusnageslag wat in hierdie selle geproduseer word, het getoon dat die meeste HCoV-229E NiRAN-mutante nie haalbaar was nie (Figuur 3E).'n Groep nie-lewensvatbare virale mutante sluit alternatiewe in wat getoon is om NMP-oordragase-aktiwiteit in vitro uit te skakel of aansienlik te verminder (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), maar daar is twee ander alternatiewe (K4116R, E4145A) % gereserveer?Hul in vitro NMPilasie-aktiwiteit dui daarop dat bykomende beperkings betrokke is.Net so het twee ander mutasies (R4178K, F4281A) wat 'n matige afname in NiRAN se in vitro NMPilasie-aktiwiteit veroorsaak het, lewende virusse geproduseer, maar hierdie virusse het titers aansienlik verminder deur replikasie.In ooreenstemming met die in vitro-aktiwiteitsdata wat in Figuur 3D getoon word, vervang vier ander residue wat nie in koronavirus en/of ander geneste virusse (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) bewaar word nie, lewensvatbare virusse geproduseer. Die nageslag het, ten spyte daarvan dat hulle 'n matig verlaagde titer in vergelyking met die wildtipe virus (Figuur 3E).
Ten einde te bestudeer of NiRAN-gemedieerde NMP-transferase-aktiwiteit afhanklik is van die aktiewe RdRp-domein, is die twee gekonserveerde Asp-reste betrokke by die koördinasie van divalente metaalione (11) in RdRp-motief C vervang deur Ala. Die resulterende proteïen nsp12_DD4823/4AA behou sy nsp9 NMPilasie aktiwiteit, wat aandui dat nsp12-gemedieerde in vitro nsp9 NMPilasie aktiwiteit nie polimerase aktiwiteit vereis nie (SI Bylaag, Figuur S4).
Nadat die nsp9-spesifieke NMP-oordragase-aktiwiteit vir nsp12 vasgestel is, het ons probeer om die NMP-nsp9-addukt deur massaspektrometrie (MS) te karakteriseer.Die volledige proteïenmassaspektrum van rekombinante HCoV-229E nsp9 het 'n piek by 12,045 Da getoon (Figuur 4A).Die byvoeging van nsp12 het nie die kwaliteit van nsp9 verander nie, wat aandui dat nsp12 en nsp9 nie 'n stabiele kompleks sou vorm onder die toestande wat gebruik is nie (denaturasie) (Figuur 4A).In die teenwoordigheid van UTP en GTP het die massameting van die reaksie wat onderskeidelik nsp9 en nsp12 bevat het getoon dat die proteïenmassa van UTP 306 Da beweeg het, en die proteïenmassa van GTP 345 Da beweeg, wat aandui dat elke nsp9-molekule 'n UMP of GMP bind (Prent 4) C en D).Daar word bespiegel dat die energie wat benodig word vir NiRAN-gemedieerde nsp9 NMPilering afkomstig is van NTP-hidrolise en pirofosfaatvrystelling.Alhoewel 'n 10-voudige molêre oormaat nsp9 (teiken) as nsp12 (ensiem) in hierdie reaksie gebruik is, is byna volledige NMPilering van nsp9 waargeneem, wat aandui dat die interaksie tussen nsp12 en nsp9 kortstondig is, en nsp12 kan meer nsp9 NMPyleer. in vitro molekule.
Enkele NMPylering van nsp9 in die teenwoordigheid van nsp12 en UTP of GTP.Getoon is die ontwikkelde volledige proteïenmassaspektrum van HCoV-229E nsp9 (SI-bylaag, Tabel S1) (AD).(A) nsp9 alleen, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 in die teenwoordigheid van UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 in die teenwoordigheid van GTP.
Om die nsp9-residue te bepaal wat deur nsp12 UMPyleer is, is nsp9-UMP met tripsien geklief.Die resulterende peptiede is geskei deur nano-hoëprestasie vloeistofchromatografie (HPLC) en ontleed deur tandem massaspektrometrie (MS/MS) aanlyn.Data-analise met behulp van die Byonic sagteware pakket (Protein Metrics) het UMPilering van die N-terminale aminosuur getoon.Dit word met die hand bevestig.Die tandem massaspektrum van die voorloper peptied [UMP]NNEIMPGK (SI aanhangsel, Figuur S5A) het 'n fragment by 421 m/z geopenbaar, wat aandui dat UMP aan oorblyfsel 1 van nsp9 bind.
By die N-terminus van nsp9 word Asn bewaar onder die lede van Orthocoronavirinae (SI bylaag, Figuur S6).Alhoewel ons glo dat die N-terminale primêre amienstikstof die mees waarskynlike aanvaarder vir UMP is, het ons besluit om bykomende bewyse van NMP-binding by die N-terminaal te verkry.Om hierdie rede is die nie-NMPilated en NMPylated N-terminal peptied nsp9 gesuiwer deur HPLC in die teenwoordigheid van asetoon en natriumsianoboorhidried verkry.Onder hierdie toestande kan slegs vry primêre amiene met propiel (25) gemodifiseer word.Die N-terminale nsp9-afgeleide peptied met die volgorde NNEIMPGK bevat twee primêre amiene, een by die N-terminus van Asn en die ander by die syketting van Lys by die C-terminus.Daarom kan propielgroepe aan beide kante ingebring word.Die onttrekte ioonchromatogramme van nie-NMPyleerde peptiede word in die SI-bylaag, Figuur S5B, getoon.Soos verwag, kan N-terminaal en C-terminaal (mono)gepropyleerde (SI-aanhangsel, Figuur S5B, boonste baan) en gedipropileerde peptiede (SI-aanhangsel, Figuur S5B, onderste baan) geïdentifiseer word.Hierdie patroon verander met die gebruik van die NMPylated N-terminal peptied van nsp9.In hierdie geval kan slegs C-terminale gepropileerde peptiede geïdentifiseer word, maar N-terminale gepropileerde peptiede en gedipropileerde peptiede word nie geïdentifiseer nie (SI Aanhangsel, Figuur S5C), wat aandui dat UMP oorgedra is na die N-terminale primêre amien Om dit te voorkom groep om veranderinge aan te bring.
Vervolgens vervang ons (met Ala of Ser) of skrap ons die bewaarde residue by die N-terminus van nsp9 om teikenspesifieke beperkings te definieer.Gebaseer op ons MS-data wat toon dat NiRAN 'n nsp9-NMP-addukt vorm met die primêre amien van die N-terminale oorblyfsel van nsp9, het ons veronderstel dat nsp9 NMPilering die virale meesterprotease (Mpro, nsp5) vereis om die nsp9 N-terminaal vry te stel van sy poliproteïenvoorloper.Om hierdie hipotese te toets, het ons 'n voorloperproteïen nsp7-11 vervaardig wat nsp9 in E. coli bevat en 'n standaard NMPileringstoets uitgevoer in die teenwoordigheid van [α-32P] UTP (materiale en metodes).Soos getoon in Figuur 5A (baan 3), is die ongesnyde nsp7-11-voorloper nie radio-gemerk met nsp12 nie.In teenstelling hiermee, as nsp7-11 deur rekombinante nsp5 gesplits word om nsp9 (en ander nsps) van die voorloper vry te stel, word 'n radiogemerkte proteïen wat met nsp9 migreer opgespoor, wat ons gevolgtrekking bevestig dat NiRAN en N-Selektiewe vorming van kovalente nsp9-NMP-addukte .Die terminale primêre amien van die N-terminale Asn (posisie 3825 in pp1a/pp1ab).Hierdie gevolgtrekking word ook ondersteun deur eksperimente wat die nsp9-konstruk gebruik, wat een of twee bykomende residue by die N-terminus bevat.In beide gevalle is NiRAN-gemedieerde UMPilering van nsp9 afgeskaf (SI Aanhangsel, Figuur S7).Vervolgens het ons 'n proteïen geproduseer met een of twee Asn-reste wat van die 3825-NNEIMPK-3832-peptiedvolgorde by die N-terminaal van nsp9 geskrap is.In beide gevalle is nsp9 UMPilering heeltemal geblokkeer (Figuur 5B), wat bykomende bewyse verskaf dat die werklike nsp9 N-terminus as 'n NMP-reseptor optree.
Die proteolitiese verwerking van nsp9 en die rol van N-terminale residue in nsp12-gemedieerde UMPilering.(A) nsp9 UMPilering vereis 'n vrye nsp9 N-terminaal.Nsp7-11-His6 word vooraf geïnkubeer by 30 °C in NMPileringsopsporingsbuffer wat UTP bevat in die teenwoordigheid of afwesigheid van rekombinante Mpro (nsp5-His6).Na 3 uur, begin die NMPyleringstoets deur nsp12-His6 by te voeg soos beskryf in Materiale en Metodes.Die reaksie wat nsp5-His6 (baan 1) en nsp9-His6 (baan 2) bevat het, is as kontrole gebruik.Na 10 minute is die reaksie beëindig en die reaksiemengsel is deur SDS-PAGE geskei.Die proteïen is gekleur met Coomassie Brilliant Blue (A, bo).Die Nsp7-11-His6-voorloper en die verwerkte produk wat voortspruit uit nsp5-His6-gemedieerde splitsing word aan die regterkant getoon.Neem asseblief kennis (weens hul klein grootte) dat nsp7 en nsp11-His6 nie in hierdie jel waarneembaar is nie, en die reaksie word aangevul met nsp5-His6 (bane 1 en 4; die posisie van nsp5-His6 word met 'n soliede sirkel aangedui) of nsp9-His6 (Baan 2) bevat 'n klein hoeveelheid MBP (aangedui deur oop sirkels) as oorblywende onsuiwerhede omdat dit as MBP-fusieproteïene uitgedruk word (SI-bylaag, Tabel S1).(B) Die Nsp9-His6-variant het een of twee N-terminale Asn-reste (residunommering volgens die posisie in pp1a/pp1ab) en word gesuiwer en geïnkubeer met nsp12-His6 en [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE gekleur met Coomassie word boaan getoon, B, die ooreenstemmende outoradiograaf word onderaan getoon.Die posisie van die molekulêre gewigmerker (in kilodaltons) word aan die linkerkant getoon.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminaal gekonserveerde residue is vervang met Ala of Ser, en dieselfde hoeveelheid proteïen is gebruik in die nsp12-His6 bemiddelde UMPileringsreaksie.Die reaksieprodukte is geskei deur SDS-PAGE en gekleur met Coomassie Brilliant Blue (C, bo), en radio-gemerkte nsp9-His6 is opgespoor deur fosforessensie beelding (C, middel).Met behulp van wild-tipe (wt) proteïen as verwysing (gestel op 100%), is die relatiewe NMPileringsaktiwiteit (gemiddeld ± SEM) uit drie onafhanklike eksperimente bereken.(D) Virustiters in die p1-selkultuur-supernatant van Huh-7-selle wat met HCoV-229E-wildtipe Huh-7-selle geïnfekteer is, en mutante wat aangewese aminosuursubstitusies in nsp9 dra, is deur plaaktoets bepaal.Die replikasie-gebrekkige RdRp-motief C dubbelmutant DD4823/4AA is as 'n negatiewe kontrole gebruik.
Die N-terminus van nsp9 (veral posisies 1, 2, 3 en 6) is baie bewaar onder lede van die Orthocoronavirinae subfamilie (SI bylaag, Figuur S6).Ten einde die moontlike rol van hierdie residue in nsp12-gemedieerde nsp9 NMPilering te bestudeer, is twee opeenvolgende Asn-residue by die N-terminus van nsp9 vervang met Ala of Ser (alleen of in kombinasie).In vergelyking met wilde-tipe nsp9, het die vervanging van N3825 met Ala of Ser gelei tot meer as 'n tweevoudige vermindering in nsp12-gemedieerde UMPilering (Figuur 5C).In ooreenstemming met ons gevolgtrekking dat NMPilering by die N-terminale primêre amien plaasvind in plaas van die syketting van die N-terminale oorblyfsel, het ons beduidende oorblywende NMPilering waargeneem met die vervanging van N3825A en N3825S.Interessant genoeg, as die tweede Asn deur Ala of Ser vervang word, word nsp9 UMPilering sterker verminder (meer as 10 keer), terwyl die vervanging van Ala by posisies 3, 4 en 6 slegs 'n matige effek op nsp9 UMPilering het (Figuur 2) ) .5C).Soortgelyke resultate is verkry met behulp van ATP, CTP of GTP (SI-bylaag, Figuur S8).Gesamentlik dui hierdie data op die sleutelrol van N2826 (posisie 2 in nsp9) in nsp9 NMPilering.
Ten einde addisionele bewyse van die funksionele korrelasie tussen die N-terminus van nsp9 en NMPilering te verkry, het ons 'n meervoudige volgorde-belyning (MSA) van die nsp9-volgorde van die Coronavirus-familie (wat wissel tussen 104 en 113 residue) uitgevoer (SI Bylaag, Figuur S6).In totaal, in 47 (bekende en vermeende) spesies van 5 genera van die Orthocoronavirinae subfamilie wat verskillende soogdiere, voëls en reptielgashere infekteer, is gevind dat slegs 8 residue in totaal onveranderlik is.Die mees uitgebreide veranderinge, insluitend delesies en invoegings, is waargeneem in die siklusse tussen die sekondêre struktuurelemente van nsp9, soos bepaal deur vorige strukturele studies (26 ??28).Vyf onveranderlike residue is gevind in die β-string en α-heliks van die C-terminale deel van nsp9.Drie onveranderlike residue vorm die NNE-motief van die N-terminus van nsp9.Dit word aan die lig gebring dat die tweede Asn van hierdie motief die enigste onveranderlike oorblyfsel is, wat ook gedeel word deur die hipotetiese nsp9 van die ver-verwante padda-koronavirus, en verteenwoordig die Microhyla letovirus 1 spesie in die subfamilie Letovirinae van Alphaletovirus.Die behoud van residue in nsp9 sekondêre struktuur elemente kan gerasionaliseer word deur strukturele oorwegings om vou of bekende RNA bindende eienskappe te handhaaf.Hierdie redenasie blyk egter nie van toepassing te wees op die bewaring van NNE nie, en voor hierdie studie was die aard van die beperkings wat die variasie van die tripeptiedvolgorde beperk, heeltemal verduister.
Om die belangrikheid van nsp9-NMPilering en NNE-bewaring in koronavirusreplikasie te bepaal, het ons HCoV-229E-mutante geproduseer, wat enkel- of dubbelsubstitusies van nsp9 N-terminale residue dra, wat aandui dat nsp9 NMPilering in vitro skadelik is.Voordat ons begin, probeer ons om die vraag te beantwoord of hierdie substitusies (naby die nsp8|9-splytingsplek) die proteolitiese prosessering van die C-terminale pp1a-gebied beïnvloed.'n Stel nsp7-11 poliproteïenkonstrukte wat ooreenstemmende substitusies by die N-terminus van nsp9 bevat is in E. coli geproduseer en met rekombinante Mpro gesny.Die proteolitiese splitsing van die vier plekke (insluitend die nsp9-flankerende plek) word nie beduidend beïnvloed deur enige ingevoerde substitusies nie (SI-aanhangsel, Figuur S9), behalwe strukturele veranderinge in hierdie proteïene wat inmeng met Mpro-gemedieerde nsp8|9-splyting (Of ander) webwerf.
Huh-7-selle is getransfekteer met genoomlengte HCoV-229E RNA, wat kodeer vir Ala- of Ser-substitusies in die bewaarde NNE-tripeptiede (N3825, N3826 en E3827) by die nsp9 N-terminus, wat toon dat die meeste van die mutasies dodelik is.Ons kon die virus red deur die Ser of Ala van die N-terminale Asn (N2835A of N2835S) te vervang, maar kon nie die virus herwin met ander enkel- en dubbelmutasies in die NNE-volgorde (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figuur 5D).
Hierdie resultate dui aan dat die replikasie van koronavirusse in weefselkultuur beperk is (dieselfde of soortgelyk), wat die natuurlike mutasie van nsp9 NMPilasieplekke in die liggaam beperk, en die sleutelrol van hierdie reaksie in die lewensiklus van koronavirusse ondersteun.
In die laaste stel eksperimente het ons C-terminaal His6 gemerk SARS-CoV-2 nsp12 en nsp9 geproduseer, en twee mutante vorms van nsp12 in E. coli.Die aktiewe terreinresidue in die NiRAN- en RdRp-domeine was onderskeidelik Gebruik Ala in plaas daarvan (Figuur 6A en SI-bylaag, Tabel S2).K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 stem ooreen met K4135 in HCoV-229E (SI Aanhangsel, Figuur S2), wat blyk te wees nodig vir NiRAN-aktiwiteit en HCoV-229E-replikasie (Figuur 3D en E).Hierdie oorskot stem ook ooreen met die arteriële virus EAV nsp9 K94-residu, wat voorheen getoon is dat dit nodig is vir NiRAN-self-UMPilering/self-GMPilering (16).Soos getoon in Figuur 6B, het SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferase-aktiwiteit deur nsp9 as 'n substraat te gebruik, terwyl die nsp12_K4465A aktiewe-plek mutant onaktief is.Die dubbele substitusie in die SDD kenmerkende volgorde van RdRp-motief C beïnvloed nie UMP-oordragase-aktiwiteit nie (Figuur 6B), wat aandui dat RdRp-aktiwiteit geen direkte effek in nsp9 UMPilering het nie.Soortgelyke data is verkry deur gebruik te maak van CTP, GTP en ATP (SI-bylaag, Figuur S10).Samevattend dui hierdie data daarop dat NiRAN-gemedieerde nsp9 NMPilering 'n konserwatiewe aktiwiteit het in koronavirusse wat verskillende genera van die ortocoronavirus subfamilie verteenwoordig.
SARS-CoV-2 nsp12-gemedieerde NMPilering van nsp9.(A) Coomassie-gekleurde SDS-poliakrielamiedgel wat die rekombinante proteïen toon wat in die NMPileringstoets gebruik is.As 'n kontrole is 'n mutante proteïen met aktiewe plaasvervanging in die NiRAN-domein (K4465A) en RdRp-domein (DD5152/3AA) van SARS-CoV-2 nsp12 gebruik.Residunommering is gebaseer op posisie in pp1ab.(B) Outo-radiografie van UMPileringsopsporing deur gebruik te maak van nsp9-His6 en [α-32P]UTP as die substraat van nsp12-His6 (wilde tipe [wt] en mutant).Die molekulêre massa (in kilodaltons) van die gemerkte proteïen word aan die linkerkant getoon.
NiRAN-domeine word oor die algemeen in Nidovirales (16) bewaar, wat aandui dat hulle ensiematiese reaksies wat noodsaaklik is vir Nidovirus-replikasie kataliseer.In hierdie studie kon ons bewys dat die NiRAN-domein van die koronavirus NMP (gegenereer vanaf NTP) na nsp9, 'n geheimsinnige RNA-bindende proteïen wat betrokke is by virusreplikasie (26 ?? 29 ), oordra om dit as 'n natuurlike teiken en vennoot van coronavirus RTC.
Die NiRAN-domein deel drie volgordemotiewe (AN, BN en CN), wat 'n baie klein aantal residue bevat wat in alle families in die monofiletiese maar hoogs gedifferensieerde Nidovirales-orde bewaar word (8, 16).Onlangse studies het getoon dat hulle struktureel verwant is aan 'n grootliks ongekarakteriseerde familie van proteïenkinase-agtige proteïene, wat oorspronklik die SelO-familie genoem is (17, 19, 22, 30, 31).SelO-verwante proteïene het kinase voue, maar ontbreek verskeie bewaar aktiewe plek residue in klassieke kinases (22, 32).Gebaseer op die omgekeerde oriëntasie van ATP-molekules gebind aan die aktiewe plek en gestabiliseer deur spesifieke interaksies, is SelO veronderstel en daarna bevestig om AMP (in plaas van fosfaat) na die proteïensubstraat oor te dra (22), terwyl 'n ander bakteriële SelO-agtige proteïen YdiU het onlangs getoon dat die kovalente aanhegting van UMP aan Tyr en His residue van verskillende proteïen substrate kataliseer (33).
Om die voorspelling van die vermeende aktiewe terreinresidue van die koronavirus NiRAN-domein te bevestig en uit te brei, het ons biochemiese en omgekeerde genetika-metodes gebruik om mutasie-analise op die koronavirus nsp12 uit te voer (Figuur 3D en E en SI-bylaag, Figuur S3 en tabel) S1â S4).Die data toon dat die vervanging van HCoV-229E K4135, R4178 en D4280 met Ala in vitro NMP-oordragase-aktiwiteit en virusreplikasie in selkultuur uitskakel (Figuur 3D en E en SI-bylaes, Figuur S3), wat hul teenwoordigheid in NTP-γ-fosfaat ondersteun ( K4135, R4178) en die koördinasie van aktiewe plek metaalione (D4280).Die E4145A-vervanging van die bewaarde Glu in die omvang van die voëlnesvirus wat voorspel word om die K4135 (17) posisie te stabiliseer, is getoon om virale replikasie uit te skakel, maar verbasend genoeg is die aktiwiteit behou in die in vitro NMPilasie-toets (Figuur 3D en E en SI-bylaag, Figuur S3 en Tabelle S1–S4).'n Soortgelyke waarneming is gemaak toe die ooreenstemmende substitusie in die YdiU-homolog van Salmonella typhimurium (E130A) ingestel is (33).Gesamentlik ondersteun hierdie data die regulatoriese funksie van hierdie bewaarde residu eerder as die katalitiese funksie.
Die vervanging van die bewaarde Phe-residu (F4281A) binne die omvang van nestovirus in die HCoV-229E NiRAN-domein (8) het gelei tot 'n afname in NMPileringsaktiwiteit in vitro en 'n beduidende afname in virusreplikasie in selkultuur (Figuur 3D, E en SI) bylaag, Figuur S3).Die data stem ooreen met die belangrike regulatoriese funksie van hierdie residu, soos die homoloë DFG-motief Phe-residu wat voorheen getoon is.In klassieke proteïenkinases is dit deel van die Mg2+ bindingslus en help om die ruggraat te monteer en te reguleer???Benodig vir effektiewe katalitiese aktiwiteit (32, 34).Die vervanging van Ala en Arg vir K4116-reste (in die preAN-motief), onderskeidelik, het virale replikasie uitgeskakel en, soos verwag, verskillende effekte op NMP-transferase-aktiwiteit in vitro gehad, afhangende van die aminosuur-syketting wat ingebring is (Figuur 3D en E en SI-bylaes) , Figuur S3).Die funksionele data is in ooreenstemming met die strukturele inligting, wat aandui dat hierdie oorskot 'n interaksie met ATP-fosfaat tot stand gebring het (17).In die NiRAN-domein van ander geneste virusfamilies word die posisie van HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 beset deur Lys, Arg of His (8), wat aandui dat die funksionele beperking van hierdie spesifieke oorblyfsel verslap is.Die vervanging van D4188A en D4283A elimineer of verminder ensiemaktiwiteit sterk en skakel virusreplikasie uit (Figuur 3).Hierdie twee residue word bewaar in die meeste (maar nie alle nie) geneste virusse (8), wat 'n belangrike familie-spesifieke maar moontlik nie-katalitiese funksie aandui.Ala substitusies van verskeie ander Lys en Asp residue (K4113A, D4180A, D4197A en D4273A) wat nie in die Coronaviridae of ander Nestioviridae families (8) bewaar word nie, is as kontroles gebruik.Soos verwag is, is hierdie substitusies grootliks verdraagbaar, met 'n effense afname in ensiemaktiwiteit en virale replikasie in sommige gevalle (Figuur 3 en SI-bylaag, Figuur S3).Oor die algemeen stem die koronavirusmutagenese-data baie ooreen met die self-GMP en omgekeerde genetiese data van EAV NiRAN-RdRp (16), waarin EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residu K94 (wat ooreenstem met HCoV- 229E K4135) belangrike funksies), R124 (korrespondeer met R4178), D132 (korrespondeer met D4188), D165 (korrespondeer met D4280), F166 (korrespondeer met F4281).Daarbenewens is die HCoV-229E mutagenese data in ooreenstemming met en uitgebrei vanaf die voorheen gerapporteerde SARS-CoV omgekeerde genetika data (16), net so baie soortgelyk aan dié wat waargeneem is vir die ooreenstemmende CN-motief Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. fenotipe beskryf -F219A en HCoV-229E_F4281A (Figuur 3 D en E en SI aanhangsel, Figuur S3 en Tabel S1-S4).
In vergelyking met EAV-ortoloë (16), wat 'n duidelike voorkeur vir UTP en GTP het (in die self-NMPileringsreaksie), toon ons studie dat die koronavirus NiRAN-domein (verteenwoordig deur HCoV-229E en SARS-CoV-2) effektief kan wees oorgedra Al vier NMP's, hoewel daar 'n effense voorkeur vir UMP is (Figure 1 en 3).Die relatief lae spesifisiteit van die spesifieke NTP-ko-substraat stem ooreen met die onlangs gerapporteerde SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supersaamgestelde struktuur, waarin ADP-Mg2+ aan die aktiewe plek van NiRAN bind, maar nie met adenien deel nie. van die vorming van spesifieke interaksies (17).In ons studie het die tipe nukleotied wat in die NMPileringsreaksie gebruik word, geen differensiële effek op die aktiwiteit van die mutante proteïen nie (SI Aanhangsel, Figuur S3), wat aandui dat geen van hierdie residue nou verwant is aan die binding van 'n spesifieke nukleobase nie.Die strukturele basis en potensiële biologiese betekenis van die verskillende NTP-ko-substraatvoorkeure wat in die NiRAN-domeine van koronavirusse en arteriële virusse waargeneem word, moet nog bestudeer word;hulle kan waar wees of kan te wyte wees aan die beperkings van hul onderskeie studies.Tans kan dit nie uitgesluit word dat die potensiële NMPilator-aktiwiteit van die arteriële virus NiRAN-domein (in vergelyking met die voorheen gekarakteriseerde self-NMPileringsaktiwiteit) 'n ander ko-substraatvoorkeur het nie, met inagneming dat die ooreenkoms tussen die arteriële en die koronavirus NiRAN-domein is op sy limiet.Volgorde-gebaseerde Vergelyk (16).In vergelyking met die pseudokinase SelO, wat Mg2+ as 'n kofaktor gebruik, is die aktiwiteit van koronavirus en arteriële virus NiRAN afhanklik van Mn2+ (16) (Figuur 3C en SI-bylaag, Figuur S1).Die Mn2+ afhanklikheid en ooglopende voorkeur vir UTP is 'n ongewone kenmerk van proteïen NMPylators, en is eers onlangs bevestig in die YdiU proteïen van Salmonella typhimurium, wat die streng Mn2+ afhanklike proteïen chaperone UMPilering kataliseer om selle te beskerm teen stresinduksie Sel ATP poel ( 33).
Die onlangs beskryfde strukturele ooreenkoms tussen die koronavirus NiRAN-domein en sellulêre proteïenkinases (17, 19) bied bykomende ondersteuning vir NiRAN se vermoë om NMP kovalent te koppel aan ander proteïene wat ons in hierdie studie gerapporteer het.Ons het ons soektog na moontlike NiRAN-teikens gefokus op die proteïene wat deur HCoV-229E ORF1a gekodeer is, wat bekend is om direk of indirek RTC se ORF1b-gekodeerde replikase te help (12, 35).Ons eksperimente verskaf afdoende bewyse vir die effektiewe en spesifieke NMPylering van nsp9 (Figuur 2).As die teikenproteïen gebruik word in 'n molêre oormaat wat 8 tot 10 keer hoër is as dié van die ensiem (nsp12), word dit bevestig dat nsp9 heeltemal (mono)NMPized is (Figuur 4).Ons het tot die gevolgtrekking gekom dat die interaksie tussen nsp12 en nsp9 kortstondig is en nie 'n stabiele kompleks met nsp9 sal vorm nie (in die afwesigheid van ander RTC-subeenhede).Hierdie gevolgtrekking word ondersteun deur proteïeninteraksiestudies oor die SARS-CoV-proteoom (35).MS-analise het die primêre amien van die N-terminale oorblyfsel van nsp9 as die NMPileringsplek geïdentifiseer (SI-bylaag, Figuur S5).Die vorming van die fosforamidaatbinding en die N-terminale aminogroep onderskei die NiRAN-gemedieerde NMPilasie-aktiwiteit van die Pseudomonas syringae SelO-gemedieerde AMPyleringsreaksie, wat die vorming van O-gekoppelde AMP by Ser-, Thr- of Tyr-residu Peptiedaddukt kataliseer ( 22), en S. typhimurium YdiU vorm O-gekoppelde (met Tyr) en N-gekoppelde (met His) peptied-UMP-addukte.Die beperkte inligting beskikbaar oor die SelO-familie van proteïene dui daarop dat lede van hierdie groot proteïenfamilie grootliks verskil in die vorming van peptied-NMP-addukte.Dit is 'n interessante waarneming wat verdere studie verdien.
Die data wat in hierdie studie verkry is, het ons daartoe gelei om te veronderstel dat die NMPilering van nsp9 'n vrye N-terminus vereis.In die konteks van virale replikasie, sal dit verskaf word deur die proteolitiese splitsing van die nsp8|nsp9 verwerkingsplek in die replikase poliproteïen pp1a bemiddel deur Mpro en pp1ab.In die meeste koronavirusse is die verskil tussen hierdie spesifieke terrein (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) en alle ander koronavirus-Mpro-splitsingsplekke Asn (eerder as 'n ander klein oorblyfsel, soos Ala, Ser Of Gly) beslaan P1â???Ligging (36).Die peptiedsplitsingsdata wat in die vroeë studies verkry is, het getoon dat die splitsingsdoeltreffendheid van die nsp8|nsp9-perseel laer was as dié van ander persele, wat aandui dat 1) hierdie spesifieke perseel ʼn regulerende rol kan speel in die tydige gekoördineerde verwerking van die C-terminaal pp1a streek, of 2) a Die rol van die spesiale bewaar nsp9 N-terminus in virus replikasie (37).Ons data (Figuur 5A) het getoon dat die rekombinante vorm van nsp9 wat die regte N-terminale volgorde dra, effektief NMPiseer is deur nsp12.Die N-terminale flankerende volgorde is verwyder deur faktor Xa (nsp9-His6; SI aanhangsel, Tabel S1) of Mpro-gemedieerde splitsing (nsp7-11-His6; Figuur 5A en SI aanhangsel, Tabel S1).Dit is belangrik dat die ongesnyde nsp9-bevattende voorloper nsp7-11-His6 weerstand teen NMPilering van nsp12 getoon het, wat ooreenstem met ons data, wat aandui dat die nsp9-NMP-addukt deur die N-terminale primêre amien gevorm word (SI-bylaag, Figuur S5) .Om 'n dieper begrip van NiRAN substraat spesifisiteit te kry, het ons toe gefokus op die aangrensende N-terminale residue van nsp9.In die afwesigheid van ander proteïene, is hulle struktureel buigsaam, wat verhoed dat hulle opgespoor word in die ongemerkte vorm van nsp9 (26 28, 38), wat hul beperkte natuurlike variasie aandui. Dit is as gevolg van die belangrike volgorde-spesifieke (nie sekondêre struktuurverwant nie) funksie van die nsp9 N-terminale fragment.Ala-substitusies van gekonserveerde residue in hierdie streek (Figuur 5C en D en SI-bylaag, Figuur S8) toon dat N3826 noodsaaklik is vir nsp9 NMPilering in vitro, terwyl N3825A en E3827A substitusies lei tot 'n afname in NMPilering, terwyl M3829A en P3830A substitusies nie .Beïnvloed natuurlik nsp9 NMPilering.Alhoewel die vervanging van N-terminaal Asn (N3825A, N3825S) slegs 'n matige effek op nsp9 NMPilering en virusreplikasie in selkultuur het (Figuur 5C en D), het die verwydering van 'n Asn-residu-volgorde van die N-terminale 3825-NN dipeptied bewys te wees Dit is dodelik vir virusse, wat aandui dat een Asn-residu nodig is voor 'n ander residu by die N-terminus, verkieslik Asn, alhoewel dit blyk dat vervanging van soortgelyke residue gedeeltelik geduld kan word (Figuur 5B, C en D).Ons kom tot die gevolgtrekking dat die 3825-NN-dipeptied, veral die behoue en noodsaaklike N3826-residu binne die koronavirusreeks (SI-aanhangsel, Figuur S6), die korrekte binding en oriëntasie van die nsp9 N-terminus in die aktiewe plek van NiRAN verseker.
Die vervanging van Ala (E3827A) vir die bewaarde Glu van alle subfamilies behou nsp9 NMPilering in vitro, maar is dodelik vir virusse in selkultuur (Figuur 5C en D), wat die bykomende funksie van hierdie residu aandui, byvoorbeeld in sleutelinteraksies (NMPylated of ongemodifiseerde) ) nsp9 N-terminus en ander faktore betrokke by virusreplikasie.Nsp9-mutasies het nie die proteolitiese proses van nsp9 of enige aangrensende nsps (39) (SI Aanhangsel, Figuur S9) beïnvloed nie, wat aandui dat die dodelike fenotipes van verskeie nsp9-mutasies wat waargeneem is nie veroorsaak is deur die disregulering van die C proteolitiese proses-terminale pp1a area .
Bogenoemde data verskaf bewyse dat na Mpro-gemedieerde behandeling van die nsp8|9-splitsingsplek in pp1a/pp1ab, die N-terminus van nsp9 UMPileer (of gedeeltelik met 'n ander NMP) gemodifiseer kan word.Daarbenewens het die uitstekende bewaring van die N-terminus van nsp9 (insluitend die enkelvoudige en onveranderlike Asn-residue in die koronavirusfamilie) en die omgekeerde genetiese data wat in hierdie studie verkry is (Figure 3E en 5D) daartoe gelei dat ons tot die gevolgtrekking gekom het dat die beskryfde nsp9 NMPylering is biologies verwant en noodsaaklik vir replikasie van koronavirus.Die funksionele gevolge van hierdie modifikasie moet nog bestudeer word, byvoorbeeld met betrekking tot die voorheen beskryfde (nie-spesifieke) nsp9 (ongemodifiseerde vorm) RNA-bindingsaktiwiteit (2628).N-terminale NMPilering kan ook die interaksie van nsp9 met proteïen of RNA substrate of die vorming van verskillende vier-vlak samestellings beïnvloed.Dit is in strukturele studies waargeneem en is bevestig dat dit funksioneel verband hou met koronavirusreplikasie, hoewel veral in die afwesigheid van In die geval van hierdie wysiging (26- ââ29, 40).
Alhoewel die teikenspesifisiteit van die koronavirus NiRAN-domein nog in meer besonderhede gekarakteriseer moet word, toon ons data dat die proteïen-teikenspesifisiteit van die koronavirus NiRAN-domein baie smal is.Alhoewel die bewaring van sleutel aktiewe plek-residu (8, 16) in die NiRAN-domein van alle nidovirusfamilies die aktiwiteit van die gekonserveerde NMPylator hierdie proteïene sterk ondersteun, moet die identiteit van die substraatbindende sakreste van hierdie domein nog gekenmerk word. , en kan verskil tussen verskillende families van Nidovirales-doeleindes.Net so moet die relevante teikens van ander geneste virusse nog bepaal word.Hulle kan afgeleë ortoloë van nsp9 of ander proteïene wees, want die volgordes buite die vyf replikase-domeine wat oor die algemeen in geneste virusse bewaar word, is minder bewaar (8), insluitend die genoomskikking tussen Mpro en NiRAN. Onder hulle is nsp9 geleë in die coronavirus.
Daarbenewens kan ons tans nie die moontlikheid uitsluit dat die NiRAN-domein addisionele (insluitend sellulêre) teikens het nie.In hierdie geval is dit die moeite werd om te noem dat die bakteriële homoloë in hierdie opkomende proteïen NMPylators (NMPylators) (30, 31) blyk te hê "meester reguleerders"?NMP moduleer 'n verskeidenheid sellulêre proteïene om hul stroomaf-aktiwiteite te reguleer of uit te skakel, en speel daardeur 'n rol in 'n verskeidenheid biologiese prosesse, soos sellulêre stresreaksie en redoks-homeostase (22, 33).
In hierdie studie (Figure 2 en 4 en SI Bylaag, Figure S3 en S5), kon ons bewys dat nsp12 die UMP (NMP) deel na 'n enkele (gekonserveerde) posisie in nsp9 oorgedra het, terwyl ander proteïene nie in die gebruik Onder die toestande word goed gedefinieerde (eerder as los) substraatspesifisiteit ondersteun.In ooreenstemming hiermee, in vergelyking met N-terminale nsp9 NMPilering, is nsp12 se eie NMPilering aktiwiteit baie laag, die opsporing daarvan vereis langer outoradiografie blootstelling tyd, en 'n 10-voudige toename in nsp12 konsentrasie word gebruik.Daarbenewens het ons MS-analise nie bewyse vir NMPilering van nsp12 verskaf nie, wat daarop dui dat NiRAN-domein self-NMPilering (ten beste) 'n sekondêre aktiwiteit is.Daar moet egter kennis geneem word dat ander studies voorlopige bewyse gelewer het dat die self-AMPileringstatus van bakteriële NMPylator hul NMPileringsaktiwiteit op ander proteïensubstrate kan beheer (22, 33).Daarom is meer navorsing nodig om die moontlike funksionele effekte van self-NMPileringsaktiwiteite wat vir EAV nsp9 (16) en koronavirus nsp12 (hierdie studie) gerapporteer is, te ondersoek, insluitend die voorgestelde chaperone-agtige effek op die vou van die C-terminale RdRp-domein ( 16)).
Voorheen is verskeie hipoteses met betrekking tot die moontlike stroomaf funksies van die nidovirale NiRAN-domein oorweeg, insluitend RNA-ligase, RNA-bedekte guanilaat-transferase en proteïen-priming-aktiwiteit (16), maar nie een van hulle is versoenbaar met die beskikbare stroomaf-funksies nie.Die inligting wat in die volgende posisies verkry word, is presies dieselfde tyd sonder om bykomende aannames te maak.Die data wat in hierdie studie verkry is, stem die meeste ooreen met (maar kan nie bewys nie) dat die NiRAN-domein betrokke is by die aanvang van proteïen-geïnduseerde RNA-sintese.Daar is voorheen geglo dat die funksie van die NiRAN-domein in 5??²-RNA-bedekking of RNA-ligasiereaksies word nie deur hierdie en Ondersteuning van ander data beïnvloed nie.Daarom word byvoorbeeld beskou dat die aktiewe terrein van NiRAN die bewaarde Asp as 'n algemene basis betrek (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (SI Aanhangsel, figuur 2) ).S2) (17, 22, 33), terwyl die katalise in die ATP-afhanklike RNA-ligase en RNA-kappende ensiem uitgevoer word deur die kovalente ensiem-(lysiel-N)-NMP-tussenproduk, wat 'n nie-veranderde Lys-residu behels ( 41).Daarbenewens is die merkwaardige volgorde-gebaseerde spesifisiteit van die koronavirus NiRAN vir bewaarde proteïen-teikens en die ontspanne spesifisiteit vir NTP-ko-substrate (verkies UTP) teen NiRAN-gemedieerde afdek-ensiem of RNA-ligase-agtige funksies.
Dit is duidelik dat baie ekstra werk nodig is om die moontlike rol van nsp9-UMP (nsp9-NMP) in proteïen-geïnduseerde RNA-sintese te verifieer en, indien bewys, uit te brei, wat verskeie interessante maar (tot dusver) verslae sal verbind wat voorheen gerapporteer is. .Geïsoleerde waarnemings.Daar is byvoorbeeld vasgestel dat die einde van die negatiewe string RNA van koronavirus begin met 'n oligo(U) string (42, 43).Hierdie waarneming stem ooreen met die idee dat die sintese van negatiewe-string RNA geïnisieer word deur die binding van die UMPylated vorm van nsp9 aan die poli(A) stert (snellers), wat bevorder kan word deur sy RNA binding. Die aktiwiteit en/of interaksie met nog 'n RTC-proteïen.Die UMP-gedeelte wat deur nsp9 verskaf word, kan dan gebruik word as 'n "primer" vir nsp7/8/nsp12-gemedieerde oligouridilering, deur gebruik te maak van die 3??²-poly(A) stert in die genomiese RNA of 'n ander oligo (A)-bevattende volgorde dien as 'n sjabloon, soortgelyk aan die meganisme wat vir die picornavirus VPg-proteïen gevestig is (44).Wat as die voorstel “nie-normatief” is????Die aanvang van die (proteïen-geïnduseerde) negatiewe string RNA sintese verskaf 'n skakel na die waarnemings, wat aandui dat die koronavirus negatiewe string RNA UMP (in plaas van UTP) aan sy einde het (42), wat beskou word om aan te dui dat die nukleïensuur Dicer klief die einde gefosforileer deur 'n onbekende uridien-spesifieke endonuklease.As dit bevestig word, kan hierdie nukleïensuurhidrolitiese aktiwiteit help om die oligomere UMPilated vorm van nsp9 vry te stel vanaf die 5 ² einde van die ontluikende negatiewe string.Die moontlike rol van nsp9 in proteïen-priming stem ook ooreen met vorige omgekeerde genetika-studies, wat getoon het dat nsp9 (en nsp8) krities en spesifiek met die bewaarde cis-werkende RNA-element naby die 3-kant van die koronavirusgenoom interaksie het.45).Volgens hierdie verslag kan hierdie vorige waarnemings nou deur verdere navorsing herondersoek en uitgebrei word.
Samevattend, ons data het die spesifieke aktiwiteit van 'n eie geneste virusensiemmerker wat aan RdRp by die N-terminus gekoppel is, bepaal.In koronavirus word hierdie nuut ontdekte NiRAN-gemedieerde UMPylator/NMPylator-aktiwiteit gebruik om op Mn2+ en aangrensende Asn-reste staat te maak en die vorming van (lae-energie) fosforamidaatbindings met die N-terminale primêre amien te veroorsaak.Deur Mpro-gemedieerde splitsing by die nsp8|9-splytingsplek, kan die nsp9-teiken vir NMPilering gebruik word, wat die funksionele koppeling tussen die protease en die NiRAN-domein aandui, wat tot RdRp strek.Die bewaring van sleutelresidu's in die nsp12 NiRAN-aktiewe terrein en die nsp9-teiken, gekombineer met data wat verkry is van twee koronavirusse insluitend SARS-CoV-2, lewer sterk bewyse dat nsp9 NMPilering 'n koronavirus is. Konserwatiewe kenmerke is ook 'n sleutelstap in virusreplikasie.Die beskikbare data lei ons tot die gevolgtrekking dat die spesifieke rol van NMPylated vorm van nsp9 in proteïen-geïnduseerde RNA-sintese 'n redelike scenario is vir koronavirus en ander geneste virusse, en NiRAN kan ook ander ongeïdentifiseerde proteïene teiken.Reguleer die virus.Gasheerinteraksie.As dit bevestig word, sal die betrokkenheid van proteïeninleiders by virale RNA-sintese die volgorde-affiniteit van die Mpro/3CLpro- en RdRp-domeine tussen die voorheen bespeurde koronavirus en picornavirus-agtige supergroep (9) verhoog, wat nou verenig is in die onlangs gevestigde Pisonivirites ( 46) in die kategorie.
Ons data toon ook dat die basiese, selektiewe en konserwatiewe ensiemaktiwiteite wat in hierdie studie geïdentifiseer is, as teikens vir antivirale middels gebruik kan word.Verbindings wat inmeng met die binding (en daaropvolgende modifikasie) van die bewaarde nsp9 N-terminus in die aktiewe plek van NiRAN kan ontwikkel word tot effektiewe en veelsydige antivirale middels, geskik vir die behandeling van dierlike en menslike koronavirusse van verskillende (sub)genus infeksies , insluitend SARS-CoV-2 en Midde-Ooste Respiratoriese Sindroom Coronavirus.
Die koderingsvolgorde van die koronavirusproteïen wat in hierdie studie geproduseer is, is versterk deur RT-PCR deur gebruik te maak van RNA wat geïsoleer is van Huh-7 geïnfekteer met HCoV-229E of Vero E6 geïnfekteer met SARS-CoV-2, en ingevoeg met behulp van standaard kloningsprosedures.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) of pASK3-Ub-CHis6 (47) uitdrukkingsvektor (SI Aanhangsel, Tabelle S1 en S2).Enkelkodonvervangings is ingestel deur PCR-gebaseerde plekgerigte mutagenese (48).Om die MBP-fusieproteïen te produseer, is E. coli TB1-selle getransformeer met die toepaslike pMAL-c2-plasmiedkonstruksie (SI-bylaag, Tabel S1).Die samesmeltingsproteïen is gesuiwer deur amilose-affiniteitschromatografie en met faktor Xa geklief.Vervolgens is die C-terminale His6-gemerkte proteïen gesuiwer deur Ni-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (Ni-IMAC) soos voorheen beskryf (49).Om die ubikitien-fusieproteïen te produseer, het E. coli TB1-selle die toepaslike pASK3-Ub-CHis6-plasmiedkonstruksie (SI-aanhangsel, tabelle S1 en S2) en pCGI-plasmied-DNS wat vir ubikitien-spesifieke C-terminale hidrolase 1 (Ubp1) kodeer, gebruik.Transformasie (47).Die C-terminale His6-gemerkte koronavirusproteïen is gesuiwer soos voorheen beskryf (50).
Die self-NMPilation toets van HCoV-229E nsp12-His6 is uitgevoer soos beskryf in EAV nsp9 (16).Kortliks, nsp12-His6 (0.5 µM) bevat 50 mM 4-(2-hidroksietiel)-1-piperazineetaansulfonsuur (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM ditiotreïtol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer, 25 µM buffer. die gespesifiseerde NTP en 0.17 µM ooreenstem met [α32-P]NTP (3 000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) by 30 °C vir 30 minute.In alle ander (standaard) NMPileringstoetse van nsp12-gemedieerde nsp9 NMPilering, word die reaksietoestande soos volg aangepas: nsp12-His6 (0.05 µM) en nsp9-His6 (4 µM) in die teenwoordigheid van 50 mM HEPES-KOH (pH 8). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM het NTP aangedui, en 0.17 µM ooreenstem met [α32-P]NTP.Na inkubasie vir 10 minute by 30°C, is die reaksiemonster gemeng met SDS-PAGE monster buffer: 62.5 mM tris(hidroksimetiel)aminometaan HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% gliserol en 0.005% broomfenol blou.Die proteïen is gedenatureer deur verhitting by 90 °C vir 5 minute en geskei deur 12% SDS-PAGE.Die jel word vasgemaak en gekleur met Coomassie Brilliant Blue-oplossing (40% metanol, 10% asynsuur, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), ontkleur en vir 20 uur aan 'n fosforescerende beeldskerm blootgestel (om nsp12 van NMPylering op te spoor) of (maksimum) 2 uur (om nsp9 NMPilering te assesseer).’n Typhoon 9200-beeldtoestel (GE Healthcare) is gebruik om die skerm te skandeer en ImageJ is gebruik om die seinintensiteit te ontleed.
Vir MS-analise is 1 µM nsp12-His6 en 10 µM nsp9 (sonder heksahistidienmerker) in NMPileringsanalise (SI-bylaag, Tabel S1) gebruik en die verhoogde konsentrasie van 500 µM UTP en GTP is gebruik.Afhangende van hul konsentrasie en verwagte proteïenkwaliteit, is 'n Waters ACQUITY H-Klas HPLC-stelsel toegerus met 'n MassPrep-kolom (Waters) gebruik om 1 tot 10 µL gebufferde proteïenoplossings aanlyn te ontsout.Die ontsoute proteïen word in die elektrosproei-ioonbron van Synapt G2Si massaspektrometer (Waters) geëlueer deur die volgende gradiënt van buffer A (water/0.05% mieresuur) en buffer B (asetonitril/0.045% mieresuur), en die kolomtemperatuur is 60 ° C en 'n vloeitempo van 0.1 mL/min: elueer isokraties met 5% A vir 2 minute, dan 'n lineêre gradiënt na 95% B binne 8 minute, en handhaaf 95% B vir nog 4 minute.
Positiewe ione met 'n massareeks van 500 tot 5000 m/z word opgespoor.Glu-fibrinopeptied B word elke 45 sekondes gemeet vir outomatiese massadrywingskorreksie.Gebruik MassLynx-instrumentsagteware met MaxEnt1-uitbreiding om die gemiddelde spektrum te dekonvoleer na aftrekking van die basislyn en gladmaak.
UMPylated HCoV-229E nsp9 is verteer deur die byvoeging van volgordebepaling-graad gemodifiseerde tripsien (Serva) en oornag by 37 °C geïnkubeer.'n Chromabond C18WP spinkolom (deelnommer 730522; Macherey-Nagel) is gebruik om die peptiede te ontsout en te konsentreer.Uiteindelik is die peptied opgelos in 25 µL water, wat 5% asetonitriel en 0,1% mieresuur bevat het.
Die monsters is deur MS ontleed met behulp van 'n Orbitrap Velos Pro massaspektrometer (Thermo Scientific).Die uiteindelike nanoâ HPLC-stelsel (Dionex), toegerus met 'n pasgemaakte eindgemonteerde 50 cm??75 μm C18 RP kolom gepak met 2.4 μm magnetiese krale (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Koppel aan die massaspektrometer aanlyn deur die Proxeon nanospuitbron;spuit 6 µL tripsienverteringsoplossing in 'n 300 µm binnedeursnee ×??1 cm C18 PepMap voorkonsentrasiekolom (Thermo Scientific).Met behulp van water/0.05% mieresuur as die oplosmiddel, is die monster outomaties vasgevang en ontsout teen 'n vloeitempo van 6 µL/min.
Die volgende gradi 5 minute, dan 30 A lineêre gradiënt na 45% B binne minute, en 'n lineêre toename na 95% oplosmiddel B binne 5 minute.Koppel die chromatografiese kolom aan 'n vlekvrye staal nano-straler (Proxeon), en spuit die eluent direk na die verhitte kapillêre van die massaspektrometer deur 'n potensiaal van 2 300 V te gebruik. Die opnameskandering met 'n resolusie van 60 000 in die Orbitrap-massaontleder word geassosieer met ten minste drie data-MS/MS-skanderings, dinamies uitgesluit vir 30 sekondes, deur gebruik te maak van lineêre ioonvalbotsinggeïnduseerde dissosiasie of hoërenergiebotsingsdissosiasie gekombineer met orbitrap-opsporing, Die resolusie is 7 500.
Postyd: Aug-03-2021